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腺相关病毒(AAV)产品手册
发布日期:2018-12-26 浏览次数 :

一、 AAV 载体概述

   腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链 DNA 病毒,是细小病毒家族的一员,通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助,才能进行自我复制。在没有辅助病毒的情况下,

   AAV 可在哺乳动物细胞中长期潜伏。现阶段已发现的 AAV 有 12 种的血清型(AAV1 至AAV12)和 130 多种突变型[1] 。不同 AAV 血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列 和组织特异性,因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别[2],这也导致不同 血清型转染的细胞类型和感染效率也各不相同。在基因治疗中,将携带有外源基因的重组 腺相关病毒定点整合到宿主基因组,既能克服随机插入所导致的染色体缺失和基因重排等 潜在危险,又可以达到长期治疗的目的。

      野生型 AAV 基因组编码两大开放阅读框架(open reading frames,ORF) rep 和 cap,它们位于两侧的末端倒转重复序列(interted teminal repeats,ITRs)之间。在 Vigenebio 的 AAV 病毒基因传递系统中,只有 ITRs 是复制和包装所必需的顺式元件,rep 和 cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒 AAV rep/cap Vector 中,转移后空出的位置 是允许外源基因插入病毒基因组中的较大限度。在辅助质粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 的帮助下,仅需两端的 ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒 颗粒。

      重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具[3],其具有广泛的宿主范围及 组织感染能力,既能感染分裂细胞,也能转导外源基因进入非分裂细胞,长期表达外源基 因,而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。在 Vigenebio 公司的 AAV 病毒基因传递系统 中,包含末端重复序列(ITRs)的载体质粒 pAV-FH AAV 载体与包含 rep/cap 基因的辅助质 粒 pAAV-rep/cap 载体没有任何共同区域,避免通过重组而恢复出野生型病毒,宿主细胞 免疫反应被降至较低,从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。我们的 AAV 病 毒基因传递系统可以生产出重组病毒滴度≥1011 病毒颗粒/毫升的病毒,浓缩后滴度可高达 1014 病毒颗粒/毫升,可以较大程度保证在动物细胞中的基因传递。rAAV 进入细胞 后,作为附加的 DNA 能稳定存在。基因的表达通常在第 2〜7 天出现峰值,并可在体内持续数周甚至数月。


二、 腺相关病毒基因传递和表达的优势

1.宿主范围广:随时可转染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂细胞;

2.多种血清型 :AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等

3.安全性高:ITR 序列和 rep/cap 基因分别由独立的质粒表达;未发现 AAV 对人体致 病,rAAV 去除了 wtAAV 基因组的 96%,进一步保证了安全性;

4.免疫原性低:AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸,便于用常规的重组 DNA 技术进行操 作,而且进行动物实验时造成的免疫反应

小。


三、 Vigenebio 腺相关病毒的优势

1)载体全:不同的启动子(神经特异性启动子 Human Synapsin、CamkIIα、GFAP 等)和多种报告基因(EGFP、mCherry、RFP 和 luciferase 等)可供客户选择;

2) 货期短:AAV 克隆载体均与我们 18,000 个预制人类全长 cDNA ORF 克隆载体 MCS 区 通用,行业中短的生产周期;

3)滴度高:可提供 1012V.G/ml 及以上滴度的病毒.,可高达 1014V.G/ml;

4)服务优:可根据客户的具体需求提供特殊定制服务。


四、 Vigenebio rAAV产品简介

      Vigenebio 独有的专利技术和创新性的 rAAV 载体和完善的 AAV 表达系统,可用于体内和体外表达 shRNA,human ORF 和 CRISPR,具有稳定可靠、重复性好、纯度高、滴度 高的优点。

      AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System)可以在无辅助病毒的条件下生产出 重组人腺相关病毒。这种系统利用已经明确与调节AAV 复制和表达的腺病毒基因产物,并 且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(Cis质 粒、辅助质粒、Rep/Cap质粒)组成。生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产 物(例如:E2A,E4 和VA RNA 基因)大部分由与其他质粒共转染进细胞的pHelper 质粒提 供,其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主细胞提供。Rep 和 Cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC 中,AAV ITRs 仍位于病毒载体中,实 际上在辅助质粒的帮助下,仅需两端的ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗 粒,Rep 和Cap 基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的较大限度。 Cis质粒、辅助质粒与Rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有 复制的能力。Vigenebio的腺相关病毒载体ITR序列Rep/Cap基因分别由独立的质粒表达,具 有高度安全性。

rAAV进入细胞和转运的过程

rAAV进入细胞和转运的过程

1.rAAV 载体


      Vigenebio 为您提供了多种腺相关病毒载体。包装 AAV 无需辅助腺病毒,非致病 性、免疫原性低。AAV 包装系统包括辅助质粒和 Rep/Cap 质粒,ITR 序列和 rep/cap 基 因分别位于独立的质粒,安全性高。多种血清型 (AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9)可供选择。根据不同客户的需要,提供了分别适用于 human ORF、shRNA 和 CRISPR 、TALEN 基因组靶向操作服务的 AAV 载体。了解更多 AAV 载体的详细信息,欢迎 访问我们的官方网站 www.vigenebio.cn。


2.rAAV 克隆服务

  2.1 rAAV Human ORF 克隆服务

腺相关病毒(AAV)载体图谱

      Vigenebio 为 human ORF 克隆设计的 pAV-FH AAV 载体,具有 Amp 抗性、CMV 启动子,带有 Flag-His 标签。多克隆位点与 Vigenebio 的 human ORF 穿梭克隆 相兼容。非常适于哺乳动物 ORF 的表达。

  

      2.2 rAAV shRNA 克隆服务

      U6启动子 腺相关病毒(AAV)图谱            H1启动子 腺相关病毒(AAV)图谱

      Vigenebio 为您提供了多种表达 shRNA 的 rAAV,包括 U6 或 H1 启动子和作为哺乳动物 表达标记的 GFP 或 RFP。同时,也可根据您感兴趣的基因提供 shRNA 设计服务。


2.3 rAAV载体容量


腺相关病毒载体能够感染分裂和非分裂细胞。毒性和免疫原性低,适合以相对较高的 转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因。但AAV载体的外源基因 容纳量有限,两个ITR之间的空间只有4.9kb,因此可插入的外源基因为3.5kb甚至更小。 请参阅本表选择适合您的病毒载体系统。

 

腺病毒

腺相关病毒

慢病毒

病毒基因组

dsDNA

ssDNA

ssRNA (+)

病毒外壳

具有包膜蛋白

基因组大小

38-39kb

5kb

9kb

感染的细胞类型

分裂和非分裂细胞

分裂和非分裂细胞

分裂和非分裂细胞

整合至宿主基因组

非整合

非整合

整合

外源基因表达

短暂

潜在的持久

长久

包装容量

7.5kb

4.5kb

6kb

免疫反应

非常低

相对病毒滴度

10E11(非纯化)

10E10-11(非浓缩)

10E7(非浓缩)

相对转染效率

100%

70%

70%

外源基因的相对表达量


五、腺相关病毒颗粒生产流程

      第一步:基因克隆。将外源基因克隆进入 Vigenebio 公司的人源或 shRNA 腺相关病毒载 体,pAV-FH AAV 等载体的多克隆位点与我们的 human ORF 穿梭克隆相兼容,非常适于哺

乳动物 ORF 的表达。

      第二步:细胞转染。将携带外源基因的重组质粒与辅助质粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 共转染进入 HEK293T 细胞,感染 72h 之后即包装完毕。

      第三步:收毒。分别收获培养基上清与细胞沉淀,PEG8000 沉淀培养基上清中的病毒,培养 基上清先用 0.45um 滤膜过滤。

      第四步:病毒纯化。通过碘克沙醇法对病毒进行纯化,一方面提高病毒滴度,另一方面某些 动物实验需要纯化之后才可进行。

      第五步:滴度检测。用 QPCR 的方法来检测病毒的滴度,得到的结果为包装得到的病毒颗粒数。


      Vigenebio 的 pAV-FH AAV 载体,具有 Amp 抗性、CMV 启动子,带有 Flag-His 标签。多克隆 位点与 Vigenebio 的 human ORF 穿梭克隆相兼容。非常适于哺乳动物 ORF 的表达。Vigenebio 为您提供了多种表达 shRNA 的 rAAV,包括 U6 或 H1 启动子和作为哺乳动物表达标记的 GFP 或 RFP。同时,也可根据您感兴趣的基因提供 shRNA 设计服务。

      pAAV-rep/cap 质粒(图)包含 AAV 编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的 rep 和 cap 基因,获得 期望的高滴度病毒产品的关键基因。

pHelper 质粒(图)包含 AAV-HEK293T 生产高滴度病毒必须的的腺病毒基因 VA,E2A 和 E4的集合。提供 AAV 生产所必需的腺病毒蛋白质 E1A 和 E1B 在 HEK293T 细胞中稳定表达。

生产流程示意图

腺相关病毒(AAV)生产流程示意图

腺相关病毒(AAV)生产流程示意图

腺相关病毒(AAV)


1.腺相关病毒重组克隆构建

    1)根据订单不同选择不同的载体,在此以人源基因克隆为例。

    2)Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF 库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容,通过酶 切,连接,转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体,得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验 证及测序以确认插曲片段的正确性。


2.细胞冻存流程

    1)按照培养细胞流程,将细胞吹下来加入 50ml 离心管中, 800g 离心 5min。

    2)配制冻存液,90% 血清,10% DMSO,混匀。

    3)离心后去上清,将配制的冻存液加入,将细胞吹匀

    4)取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中,做好标记和日期。

    5)放入装有异丙醇的冻存盒中,放入-80 度冰箱过夜。(冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室 温,使异丙醇的温度达到室温,每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上)。

    6)第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。


3.细胞复苏流程


    1)10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基,放培养箱预热至 37℃。

    2)从液氮中取出冷冻管,迅速投入 37 ℃ ~38℃水浴中,使其融化(1-2 分钟左右)。

    3)待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。

   4)摇晃均匀,放培养箱培养。

    5)4h 后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基(除去冻存液中 DMSO 对细胞的毒害作用。也可在第 3步中 800g 离心 5min,除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中)。


4.细胞培养流程(以 10cm 细胞培养皿,传代为例)

    1)生物安全柜紫外灭菌半小时。

    2)灭菌期间,DMEM 培养基(含 10%FBS,1%青链霉素混合液)、PBS 以及 0.25%胰酶在 37℃水浴锅中预热。

    3)取汇合度接近 100%活性好的的 HEK293T 细胞,吸弃培养盘中培养基,加约 5ml,1×PBS,摇晃几下,吸弃 PBS。(加 PBS 目的主要除去残留在皿中的培养基中的 FBS,以提 高胰酶的消化效率)

    4)加 1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约 1min,室温低时可放置于培养箱中消化。消 化时间不宜过长,否则影响细胞再次贴壁效率和活性。

    5)加入约 5ml 的预热的培养基。

    6)用移液管吹打均匀,按照 1:3 比例传代。各洗 2ml 培养基至新的 10cm 皿中,再加入8ml 预热的 DMEM 培养基。(吹打过程中不可用力过大,否则会吹破细胞)。

    注意:传代盘数较多时,要先将预热的 DMEM 培养基加入到 10cm 皿中,再加入含细胞的培 养基,以避免细胞分布不均。放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基,使细胞均匀分散于 培养基中。细胞培养条件为 5%-7%CO2 浓度,37℃,培养箱内无菌水盘内水份提供一定的 湿度。细胞传盘以及分 6 孔板,24 孔板,96 孔板分细胞都经过上述流程,只是细胞数与分的比 例不同,具体情况具体操作。


5.AAV 病毒包装


    以 10cm 细胞培养皿为例

    第一天: 聚合度 90%以上的 HEK293T 细胞按 1:3 比例传盘(每盘大约 2.5 x 106),培 养基 Hyclone 高糖 DMEM 培养基(含 10%FBS)。

    第二天: 转质粒前 1-2h 左右,换成无血清培养基(所有血清型 AAV),用转染试剂将目 的基因质粒和辅助质粒(需用酚氯仿提取的质粒)转入 HEK293T 中。

    第三天:质粒转化 24h 后,换新的无血清培养基(所有血清型 AAV)

    第五天:转染 72h 收毒。带着培养基,吹下细胞,离心;然后分别收获培养基上清与细胞 沉淀。用 PEG8000 沉淀培养基上清中的病毒,沉淀过夜后收集病毒沉淀。


6.AAV 病毒纯化

    1)收集病毒沉淀和细胞沉淀。

    2)细胞沉淀-80℃保存,后续实验用。

    3)破碎细胞。

    4) 将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。


7.病毒浓缩

    用超滤管进行浓缩。


8.病毒滴度检验

     1)腺性相关病毒处理破除 AAV 病毒外壳 ,37 ℃ 孵育 30 min,然后加热 95 ℃5 min 使 酶失活,体系如下:

                                                                           组成成分               体积

                                                                              病毒液                 5ul

                                                                       蛋白酶 K(5ug/ul)    1ul

                                                                                超纯水               4ul

    2)离心 12000rpm,2min.取上清。

    3)标准品的拷贝数,7 个梯度稀释浓度分别:

    7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V. G./UL,7.2E+2V.G./UL.并将超纯水作为阴性对照。

    4)配制 PCR 反应体系,每个样品 20 ul 体系,体系如下:

                                                                         组成成分                              体积

                                                                    2X SYBRGreen 缓冲液               10ul

                                                                        F、R 引物混合物                   0.8ul

                                                                            超纯水                               7.2ul

                                                                       病毒样品或标准品                   2ul

     5)PCR 反应体系

                                                                       

95℃       5min;

95℃         15sec

60℃         15sec

72℃        15sec

40 个       cycles

    6)病毒颗粒数公式:病毒颗粒数(个/ml)= 与标准品相对值 × 1000


六、 腺相关病毒感染目的细胞预实验


      以 2 型 AAV 病毒为例,Vigenebio 为您推荐的 MOI 值 10000:1-100000:1,是根HEK293T 细胞得出的数据,不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议您感染目的 细胞前,进行预实验摸索最佳 MOI 值,推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。

    1. 为了节省病毒,推荐使用 96 孔板进行预实验。

    2. 将目的细胞接种于 96 孔板中,细胞融合率为 50%较佳。为保证细胞生长良好,请保 证细胞贴壁过夜。

    3. 取 10ul AAV 病毒原液加入 90 ul 培养基中做 1:100 稀释(10-2),以此为起点做梯度 稀释直至稀释 10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

   4. 取出提前准备好的 96 孔板,先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替 代旧培养基,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

   5. 在加入病毒稀释液后,请在 12-24h 后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适,是 否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化,即所加病毒对细胞没有毒性,可 以继续培养。

   6. AAV 病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。 (成功 案例: 山大医院学生利用我司提供的 AAV 病毒感染 jurkat,ca46 细胞,在 MOI 值 105 时,一个星期后看到荧光表达,并且成功通过 WB 检测到目的基因的表达)(如果您选择的产

品带有 GFP 标签,如果没有荧光标签请选择在 96 小时以后的不同时间段分别收获细胞 并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达)。

注:由于 AAV 组织特异性,体外感染细胞的效率比较低,所以我们强烈推荐您购买 AAV用于动物实验。


七、 AAV 使用情况实例分析


1.AAV 感染不同种类的细胞

      AAV 虽然也可体外感染一些细胞,但感染效率比较低。具体感染效率可以参考本手册的常见问题 解答中的附表。

2.AAV 感染神经干细胞

GFP NESTIN MERGE

Sorted cells were expanded for an additional26 days (total 40 days after AAV infection), and ~94.5% of cells maintained GFP and nestin expression

Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(4):

667-675.

由于 AAV 的低免疫原性,即便感染干细胞,也不会引起细胞的分化。

3. 各种类型的重组 AAV 注射入不同神经发育阶段的小鼠脑内产生不同分布

 各种类型的重组 AAV 注射入不同神经发育阶段的小鼠脑内产生不同分布

Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680. 注射方法:脑室注射10注射剂量:2×10v.p


4.不同血清型的 AAV 感染心脏心肌细胞

由于组织特异性,即便提高病毒的注射量,对于低表达的血清型,其所携带基因的表达水 平没有太大的改善。由图可知,AAV9 型对心肌细胞的感染效率极高,AAV8 次之。


5. 重组 AAV1-SERCA2a 转导入猪冠状动脉的表达

5. 重组 AAV1-SERCA2a 转导入猪冠状动脉的表达

Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

注射方法:冠状动脉注射注射剂量:1012v.p


6. AAV1 特异性感染中枢神经系统以及不同类型 AAV 感染中枢神经系统的效果

6. AAV1 特异性感染中枢神经系统以及不同类型 AAV 感染中枢神经系统的效果

Edmund R Hollis II, Ken Kadoya, Matthew Hirsch, Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski

,Molecular Therapy , vol16 ,no. 2, feb, 2008.

注射方法:神经肌肉注射 注射剂量:2.1x10E8 v.p

分别用 AAV1-6 感染中枢神经系统,AAV1 的效果较好,感染运动神经元的数目较多。

7.不同血清型 AAV 体外注射大鼠 5 天后在脑的海马回中的表达

7.不同血清型 AAV 体外注射大鼠 5 天后在脑的海马回中的表达

Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006, 3 , 13(3).

8.AAV2 在研究小鼠脉络膜新生血管形成中作为基因导入的载体

Therapeutic effect of CBAPEDF-AAV2 on choroidal neovascularization development and antibody responses to AAV2 capsid following single and sequential intravitreal injections.

A-D:Representative CNV images from mouse eyes that were untreated (A), received a single intravitreal (IV) treatment (B), received first IV treatment (C), and received a second

IV treatment (D) of AAV2-PEDF.

Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769. 注射方法:玻璃体腔内注射

注射剂量:4x10E10 V.G.

9.AAV7,8 感染视锥形细胞

AAV7,8 感染视锥形细胞

AAV7,8 感染视锥形细胞

注射方法:在接近晶状体的虹膜上切开一个小口后,缓慢(20-30 秒内)注射。至少在 3个星期后进行后续的实验。 注射剂量:2ul。

10. scAAV9 介导的 CB-GFP 标记静脉注射入大鼠 3 周后在脑的星形胶质和神经元中表

a:纹状体; b:海马回;c:齿状回;d :小脑浦肯野细胞; e:海马回的椎体细胞 f:齿状回的颗粒细胞;

a-d 新生鼠 e-f 成年鼠(f)200 mm (e); 100 mm (f),50 mm (a–d)

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法:尾静脉注射注射剂量:4 × 1011v.p

11.AAV8 感染肝脏肝细胞

AAV8 感染肝脏肝细胞

注射方法:尾部静脉注,注射体积:200ul、1012v.p

12. AAV9 介导的标记注射成年小鼠 7 周后在脊髓和大脑的表达

AAV9 介导的标记注射成年小鼠 7 周后在脊髓和大脑的表达

a-d:颈椎,e-h:腰椎,i-l:星形胶质细胞,m-p:脑

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult

astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法:尾静脉注射注射剂量:4 × 1012v.p

13. AdVLacZ, AAV2LacZ, 和 AAV8LacZ 介导的标记在 C57Bl/6 鼠的胰腺中的表达

AdVLacZ AAV2LacZ AAV8LacZ

胰腺胰岛细胞

Wang A Y, et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo[J]. Human gene therapy, 2004, 15(4): 405-413. 注射方式:胰腺注射,注射剂量: AdVLacZ-10 pfu;AAV2,8LacZ-10v.p

AAV 比腺病毒的持续表达时间要长很多,通常 AAV 可在体内表达数周甚至数月,但是腺病 毒仅能表达几天。

14. AAV-1-6,8 和慢病毒介导的 GFP 在大鼠的脊髓中的表达

AAV-1-6,8 和慢病毒介导的 GFP 在大鼠的脊髓中的表达

Blits B, Derks S, Twisk J, et al.Journal of neuroscience methods, 2010, 185(2): 257-263.注射方法:脊髓注射,注射剂量:注射 5×108

v.p 不同外壳的 AAV 病毒

由图显示,AAV 介导的在大鼠脊髓中的基因表达要比慢病毒介导的表达更高。AAV 比慢病 毒更容易转染脊髓。

六、常见问题解答

1.什么是 Adeno-associated virus (AAV) &重组 AAV(rAAV) & helper free rAAV?

腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科,是一类小的、二十面体、无包膜病毒。AAV 是一种 复制缺陷病毒,复制依赖于其他辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。AAV 不编码自己的聚合 酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。

重组 AAV(rAAV)是人工改造的 AAV,没有编码 AAV 病毒复制和结构蛋白的 rep 和 cap 基 因。rAAV 中与复制和包装相关的 rep 和 cap 基因被替换为 ITRs 间的基因或结构,这使 rAAV 具有 4.1-4.9 kb 的包装容量。

2.使用 AAV 有哪些生物安全性要求?

可在生物安全 1 级(BSL-1)实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组 AAV。 另外,应在生物安全 2 级(BSL-2)实验室封闭处理具有生物危害性的材料。

3.重组 AAV 安全吗?

迄今为止,未发现野生型 AAV 有致病性。野生型 AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存 在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis 质粒、辅助质粒、 rep/Cap 质粒)组成。Cis 质粒、辅助质粒与 rep/Cap 质粒之间不具有同源性序列,因此 重组 AAV 在理论上不具有复制的能力。

4.重组 AAVs 的克隆容量有多大?

AAV 具有〜4.7Kb 的包装能力。2 个 ITR 之间插入的 DNA 长度接近允许的较大值 4.7Kb 时,包装效率显著降低。例如,对于过表达来自 cDNA 的基因,CMV-poly(A)信号元件约 为 1KB,因此可包装的 cDNA 长度约为 3.2kb,如果共表达 GFP(约 0.8kb),则可包装的容量大约为 2.4kb。

5.哪些血清型的 AAV 可供选择?我该选用哪种 AAV 呢?

目前为您提供的 AAV 血清型为 AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 & AAV9。请参阅 下面指南中参考文献的建议。

AAV 血清型为 AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 &	AAV9

AAV

Serotype

Muscle

Hepatocyte

Pulmonary

Brain

Retinal

pigmented epithelium

Pancreas

Kidney

 

AAV1

 

X

 

 

neuons

and glial cells

 

X

 

X

 

AAV2

 

 

 

 

 

 

X

 

AAV5

 

 

lung alveolar cells

neuons

and glial

cells

 

X

 

 

 

AAV6

 

X

 

 

X

 

 

 

 

AAV7

X

 

 

neurons

X

 

 

 

AAV8

 

X

 

X

 

 

neurons

 

X

 

X

 

 

AAV9

 

X

 

X

 

X

 

 

X

 

X

 

X

请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型 AAV 更适合您的细胞。

6.使用重组腺相关病毒 rAAV 传递基因的优势是什么?

rAAV 病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间 长。

7.AAV 载体稳定吗? 如何保存 AAV 载体?

纯化的 AAV 载体在 4℃或更低温度下高度稳定。建议您将 AAV 分装后,-80℃下长期保 存。

8.订制 AAV 服务,客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?

您可以从我们的人源全长 cDNA 库(17,000 预制 ORF)中挑选,或者提供您的质粒 DNA 或

DNA 序列,我们将基因克隆至 AAV 载体。您还可以指定特定的融合标签和 AAV 血清型。

基因沉默服务,请您提供确切的 shRNA 的序列以构建重组 rAAV 载体。我们的标准载体具 有 U6 启动子和 GFP 标记。

通常情况下,可为客户提供 500 ul 病毒液 1×10^12 V.G. /ml。也可根据客户的需要, 提供特定体积和滴度的产品。

七、 腺相关病毒安全操作规范

1. 请在 BL2 生物安全二级生物安全柜中操作病毒。

2. 操作病毒和转染细胞时,请务必穿着实验服,佩戴口罩和手套。

3. 请小心操作,避免产生气雾或飞溅。被病毒污染的超净工作台,请立即用 70%乙醇加1% SDS 溶液擦拭干净。接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请使用新鲜配制的 10%漂白粉进行消毒操作后丢弃。

4. 用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用 70%乙醇擦拭培养 瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用 70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。

5. 离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用组 织培养室内的离心机。

6. 实验完毕脱掉手套后,请立即用肥皂和水清洗双手。

个人保护措施

1. 使用一次性手套。

2. 在注射病毒或是其后的解剖时,使用一次性手术服或是相当的衣物,如果是感染细胞 时,可以穿着实验服。

3. 佩戴护目镜或是面罩。

4. 所有的操作应当是在 Class II 生物安全柜中进行。如果实验条件不能满足,则应当 在空气稳定的空间中操作,减少操作时间和病毒与外界接触的时间。

不慎接触病毒时的急救

1. 病毒飞溅或是气溶胶与人体接触–眼,皮肤或是粘膜用大量清水冲洗眼睛或是其他接触的部位至少15 分钟。

2. 含病毒的针头或是其他利器刺破皮肤。伤口立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟,然后用 大量清水冲洗。

消毒处理

对AAV 较有效的消毒剂是新鲜配制的1%次氯酸钠溶液。

♦  配制时,将84 消毒液原液加水稀释。

♦  浸泡15min 以达到消毒目的。

♦  可以用它处理可回收的物品如玻璃器皿或是污染废液(终浓度是1%),但如果是不锈 钢器物切不可直接擦拭,否则会引起表面腐蚀。

其他的处理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS 溶液,还可以121℃高温消毒1小时。

腺相关病毒的保存

收到产品后,请根据实验所需的量在无菌操作台中将病毒进行分装,并于-80 ℃冰箱冻存。分装病毒时请将病毒始终放置在冰上。 注:请避免反复冻融。

八、 参考文献

[1] Daya, S. and K.I. Berns, Gene therapy using adeno-associated virus vectors. ClinMicrobiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.

[2] Ding W,Zhang L,Yan Z,et al.Intracellular trafficking of adeno-associated viral vectors.Gene Therapy,2005,12(11):873~880

[3] Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. and Nairn, R. (1977) J Gen Virol 36(1):59-74.

[4] Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy,2011, 19(4): 667-675.

[5] K-MR Prasad , et al. Gene Therapy , 2011, 18, 43-52.

[6] Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680.

[7] Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

[8]Klein R L, Wang D B, King M A. Versatile somatic gene transfer for model ing neurodegenerative diseases[J]. Neurotoxicity research, 2009, 16(3): 329-342.

[9] Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

[10]Blits B, Derks S, Twisk J, et al.Journal of neuroscience methods, 2010, 185(2

): 257-263.

[11] Edmund R Hollis II, Ken Kadoya, Matthew Hirsch, Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski ,Molecular Therapy , 2008, 16(2).

[12] Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006,13(3).

[13] Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769.


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