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慢病毒系统产品手册
发布日期:2018-12-26 浏览次数 :

一、产品介绍

Vigenebio 慢病毒载体 可 具有各种标签和荧光标记 ,其中大部分都 具有与 Vigenebio率先推出的pEnter穿梭载体相同的MCS多克隆位点及筛选标记。Myc、Flag、 His、HA等融合标签方便改造,可依据您的需要添加在N端或C端。与质粒载体相比,慢病毒载体可以产生更加稳定的体外转染,Vigenebio提供的慢病毒载体如下:


用途

慢病毒载体

 

 

 

 

 

 

 

 

 

过表达

pLent-GFP-Puro-CMV

pLent-RFP-Puro-CMV

pLent-Puro-CMV

pLent-GFP-Blasticidin-CMV

pLent-RFP-Blasticidin-CMV

pLent-Blasticidin-CMV(EF1a 启动荧光报告基因/筛选标记;

CMV 启动插入基因,C 端融合 Myc-Flag 标签)

pLent-EF1a-FH-CMV-GFP-P2A-Puro(EF1a 启动插入基因,C 端融 合 Myc-Flag 标签;CMV 启动荧光报告基因和筛选标记)

 

 

 

 

干扰

pLent-U6-GFP-Puro

pLent-U6-RFP-Puro pLent-H1-GFP-Puro pLent-H1-RFP-Puro pLent-U6-Puro

 

 

其他

pLent-MIR-GFP-Puro

pLent-MIR-RFP-Puro(microRNA 双标载体,可构建 microRNA 过 表达和 sponge 抑制克隆)

pLent-EF1a-Puro-CMV-Luciferase

注:更多慢病毒载体信息可登陆 www.vigenebio.cn 网站查看或咨询 Vigenebio 技术支持。

慢病毒载体图谱:

慢病毒载体图谱

注:更多载体图谱信息可登陆 Vigenebio 网站查看。

二、操作步骤

(一)慢病毒安全操作规范

Vigenebio 慢病毒载体是第三代慢病毒载体,其 3' LTR 的增强子功能发生缺失,形 成了自灭活(sefl-inactivating,SIN) 的 3’ LTR, 5’LTR 中的 U3 区替换成 CMV,是较安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警惕,严格按照以下操作规范进 行:

1.使用慢病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。

2. 请在 BL2 生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。

3. 请务必穿着实验服,佩戴一次性口罩和手套。

4. 小心操作,避免产生气雾、飞溅或洒落。

5.被病毒污染的超净工作台,请立即用加入 1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干净;请务必 将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的 10%漂白粉、84 消毒液或

0.6%次氯酸钠溶液浸泡 1 小时以上再丢弃。

6. 装盛慢病毒的实验用品需单独放置及培养,并加以标示。

7.用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用 70%乙醇擦拭培养 瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用 70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。

8. 离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用 组织培养室内的离心机。

9. 实验完毕脱掉手套后,请立即用肥皂和水清洗双手。

10.对共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。

(二)慢病毒感染目的细胞预实验

不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议在正式实验前,在目的细胞中进行 预实验摸索最佳 MOI 值。

为了节省病毒,推荐使用 96 孔板进行预实验。操作步骤如下:

1. 第一天 细胞的准备

将目的细胞接种于 96 孔板中,细胞融合率为 50%较佳。为保证细胞生长良好,请保 证细胞贴壁过夜。

2. 第二天 病毒的稀释

取 10μL 慢病毒原液加入 90μL 培养液中做 1:100 稀释(10-2),以此为起点做梯度稀 释直至稀释 10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

3. 第二天 感染目的细胞

取出提前准备好的 96 孔板,用准备好的病毒稀释液替代旧培养液,注意保留未加入病 毒的细胞孔作为对照组。

4. 第二至十天 观察荧光或检测

慢病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后 48、72、96、120 小时分别观察细胞中荧光 表达情况(如果您选择的产品不带有荧光标签,请在 48、72、96、120 小时分别收获细 胞并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达)。

注意事项:由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同,在加入病毒稀释液后,

请于 12-24 小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。

(三)慢病毒滴度测定

Vigenebio慢病毒单位为TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。 如:病毒滴度为>1×108  TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108个具有生物活性的慢病 毒颗粒。

慢病毒的病毒滴度(TU/mL)可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定,具体操作 步骤如下:

1. 第一天 细胞的准备

在96孔板中的每个孔中接种1-4×104个 HEK293细胞。

2.第二天 病毒的稀释和感染。 在Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为:每种病毒准备8个1.5mL Eppendorf 管,每管加入297μL完全培养液,向第一个管中加入33µL病毒原液,混匀后,吸取

30µL加入第二个管混匀。依此类推,做8个稀释度(10~10-6)。弃去96孔板中原有的培 养液,每个稀释度重复3个孔,每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。

实验预览如图:

慢病毒实验数据

1. 第五天 荧光计数和滴度计算

用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出后两个能观察到荧光的孔内的荧光细 胞数,计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数,假设为A(倒数第二个能见荧光 孔的荧光细胞平均数)和B(倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。 慢病毒病毒滴度计算公式:

病毒滴度 (TU/mL) = (A+B×10)×1000/2/A孔病毒量(μL)

(四)慢病毒感染目的细胞

进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液(培养目的细胞用)稀释。培养液中的血 清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。

以 24 孔培养板为例,进行 HEK293 细胞的感染实验操作步骤如下: 注意事项:实验前请按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据 MOI 和细胞数量计 算所需要的病毒量。

1. 第一天 细胞的准备

在 24 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3-5×104 个 HEK 293 细胞,铺板时细胞的 融合率为 50%左右,每孔培养液体积为 300μL,进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右。

2. 第二天 病毒的准备

根据实验的实际情况和 MOI 值,用培养液准确稀释慢病毒原液。 注意事项:可使用 PBS 缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。

3. 第二天 感染目的细胞

在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液, 混匀后放于二氧化碳培养箱(37 ℃、5% CO2)孵育过夜。 注意事项:

1)感染前细胞的状态好坏对感染效果影响很大,请务必保证加入病毒前, 细胞处于良好的生长状态。

2)若慢病毒对目的细胞的感染效率较低,可通过提高 MOI 值提高病毒的感染效率,也可在培养液中加入助感染试剂 ADV-HR(详见附录 1、附录 4、附录 5)来提高病毒的感染效率。

4. 第三天 更换培养液

病毒感染细胞 24 小时后,更换培养液。 注意事项:换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用,影 响细胞生长状态,可于加病毒 4 小时后更换新鲜培养液后继续培养。

5. 第六天 感染效率检测 在倒置荧光显微镜观察荧光,计算慢病毒感染目的细胞的效率。如选择的慢病毒载体 不带有荧光标记,可以通过 Q-PCR(定量 PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。 注意事项:

1)慢病毒表达较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染 96 小时后观察荧光的表达。

2)感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对 目的细胞的感染情况。

3)感染期间,请根据细胞生长的情况及时换液,以保证细胞良好的生长状态。

三、附录

附录1. 常见问题解答

1.慢病毒感染后,细胞状态很差,甚至出现死亡,为什么? 慢病毒会对细胞造成一定的毒性,不同细胞对毒性的耐受力不同。建议您 降低感染时使用的MOI值,即可在细胞准备时增加铺板细胞的融合率(可 提高至70%)或/和降低感染时加入的病毒量。此外,还可选择在感染4小 时后换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。

2.怎样提高慢病毒的感染效率?

细胞良好的生长状态和感染时适合的MOI值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的MOI值来提高病毒的感染效率,必要时可在感染 时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率。

3.助感染试剂ADV-HR的使用浓度和使用方法是什么?

助感染试剂ADV-HR能够显著提高慢病毒的感染效率,并呈现剂量和时间依 赖效应(详见附录4)。但较高浓度的ADV-HR具有细胞毒性,影响细胞状 态和感染效率。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实

验。我们在HEK293中的实验表明(详见附录5),当ADV-HR使用浓度小于

等于1.0×10-2mg/mL时,细胞状态良好。 此外,对于较难感染的细胞系(如CNE2)建议使用“孵育法”,即将助感 染试剂、慢病毒和一定数量的细胞悬液加至1.5mL Eppendorf管中,轻轻

混匀,置于37℃培养箱中孵育0.5至1小时后转至培养皿中培养;对于较易 感染的细胞系(如HepG2)建议使用“直接加入法”,即在感染时,直接 将助感染试剂、慢病毒滴加至培养皿中。建议您针对目的细胞的具体情 况,选择合适的感染方法。

4. 慢病毒载体可插入多大的ORF片段?

一般情况下,慢病毒载体可容纳8 kb插入片段。然而,插入的ORF基 因大于4 kb时会大大降低病毒的包装效率,进而影响病毒滴度甚至基因表 达。

附录 2. Vigenebio 慢病毒感染 HEK293 细胞案例

慢病毒感染HEK293细胞

109TU/mL

MOI≈10

感染后 48 小时拍照

附录 3. Vigenebio 慢病毒滴度测定案例

Vigenebio 慢病毒滴度测定案

3.046×109  VP/mL

3.20×108TU/mL

感染后 72 小时拍照

附录 4. 助感染试剂 ADV-HR 在慢病毒感染中的作用

	助感染试剂 ADV-HR 在慢病毒感染中的作用

109VP/mL	助感染试剂 ADV-HR 在慢病毒感染中的作用

感染后 48 及 110 小时拍照

附录 5. 摸索助感染试剂 ADV-HR 的使用极值实验

摸索助感染试剂 ADV-HR 的使用极值实验

摸索助感染试剂 ADV-HR 的使用极值实验

实验规模:96 孔板(定容至 100μL)

ADV-HR 浓度:1mg/mL

说明:

1. ADV-HR 终浓度在 0 至 1.0×10-2mg/mL 之间对细胞状态无影响;

2. ADV-HR 终浓度在 2.5×10-2mg/mL 时细胞生长缓慢;

3. ADV-HR 终浓度在 5.0×10-2 至 1.0×10-1mg/mL 时细胞呈现明显破碎, 2.5×10-1 至

5.0×10-1mg/mL 时细胞皱缩甚至停止生长。 建议:

1. 请在使用 ADV-HR 前于目的细胞中进行浓度梯度预实验;

2. 建议 ADV-HR 的使用浓度不超过 2.5×10-2mg/mL。

附录 6. 慢病毒(shRNA)感染构建稳转株成功案例

慢病毒(shRNA)感染构建稳转株成功案例

慢病毒(shRNA)感染构建稳转株成功案例

shRNA 载体:pLenti-U6-GFP    抗性:嘌呤霉素(Puromycin)    筛选周期:三周




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