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腺相关病毒处理
发布日期:2017-06-05 浏览次数 :

1.腺相关病毒重组克隆构建

   1)根据订单不同选择不同的载体,在此以人源基因克隆为例。

   2)Vigenebio公司的AAV载体与我们的人源ORF库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容,通过酶切,连接,转化的方式将基因亚克隆进入pAV-FH AAV载体,得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。

2.细胞冻存流程

1)按照培养细胞流程,将细胞吹下来加入50ml离心管中, 800g离心5min。

2)配制冻存液,90% 血清,10% DMSO,混匀。

3)离心后去上清,将配制的冻存液加入,将细胞吹匀

4)取上述溶液1ml分至1.5ml细胞冻存管中,做好标记和日期。

5)放入装有异丙醇的冻存盒中,放入-80度冰箱过夜。(冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温,使异丙醇的温度达到室温,每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上)。

6)第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。


3.细胞复苏流程

1)10cm培养盘中加10cm新鲜DMEM培养基,放培养箱预热至37℃。

2)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37 ℃ ~38℃水浴中,使其融化(1-2分钟左右)。

3)待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。

4)摇晃均匀,放培养箱培养。

5)4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基(除去冻存液中DMSO对细胞的毒害作用。也可在第3步中800g离心5min,除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的DMEM细胞培养皿中)。

4.细胞培养流程(以10cm细胞培养皿,传代为例)

1)生物安全柜紫外灭菌半小时。

2)灭菌期间,DMEM培养基(含10%FBS,1%青链霉素混合液)、PBS以及0.25%胰酶在37℃水浴锅中预热。

3)取汇合度接近100%活性好的的HEK293T细胞,吸弃培养盘中培养基,加约5ml,1 ×PBS,摇晃几下,吸弃PBS。(加PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的FBS,以提高胰酶的消化效率)

4)加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约1min,室温低时可放置于培养箱中消化。消化时间不宜过长,否则影响细胞再次贴壁效率和活性。

5)加入约5ml的预热的培养基。

6)用移液管吹打均匀,按照1:3比例传代。各洗2ml培养基至新的10cm皿中,再加入8ml预热的DMEM培养基。(吹打过程中不可用力过大,否则会吹破细胞)。

注意:传代盘数较多时,要先将预热的DMEM培养基加入到10cm皿中,再加入含细胞的培养基,以避免细胞分布不均。放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基,使细胞均匀分散于培养基中。细胞培养条件为5%-7%CO2浓度,37℃,培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度。

细胞传盘以及分6孔板,24孔板,96孔板分细胞都经过上述流程,只是细胞数与分的比例不同,具体情况具体操作。


5.AAV 病毒包装

以10cm细胞培养皿为例

第一天: 聚合度90%以上的HEK293T细胞按1:3比例传盘(每盘大约2.5 x 106),培养基Hyclone高糖DMEM培养基(含10%FBS)。

第二天: 转质粒前1-2h左右,换成无血清培养基(所有血清型AAV),用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒(需用酚氯仿提取的质粒)转入HEK293T中。

第三天:质粒转化24h后,换新的无血清培养基(所有血清型AAV)

第五天:转染72h收毒。带着培养基,吹下细胞,离心;然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒,沉淀过夜后收集病毒沉淀。

6.AAV病毒纯化

1)收集病毒沉淀和细胞沉淀。

2)细胞沉淀-80℃保存,后续实验用。

3)破碎细胞。

8) 将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。

7.病毒浓缩

用超滤管进行浓缩。

8.病毒滴度检验

1)腺性相关病毒处理破除AAV病毒外壳 ,37 ℃ 孵育30 min,然后加热 95 ℃5 min 使酶失活,体系如下:

组成成分

  体积

病毒液               

5ul

蛋白酶K(5ug/ul)

1ul   

超纯水

4ul

2)离心12000rpm,2min.取上清。

3)标准品的拷贝数,7个梯度稀释浓度分别:7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V.G./UL,7.2E+2V.G./UL.并将超纯水作为阴性对照。

4)配制PCR反应体系,每个样品20 ul体系,体系如下:

组成成分

  体积

2X SYBRGreen缓冲液            

10ul

F、R引物混合物

0.8ul

超纯水

7.2ul

病毒样品或标准品    

2ul

 

5)PCR反应体系

组成成分

  体积

95             

5min;    

95    

15sec

60      

15sec

72     

15sec

40个cycles

 

6)病毒颗粒数公式:病毒颗粒数(个/ml)= 与标准品相对值 × 1000



























        

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