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腺病毒滴度测定
发布日期:2017-06-05 浏览次数 :

实时定量PCR法是一种简单的、高通量的测定病毒粗提裂解液和纯化病毒样本中腺病毒颗粒数量的方法。该方法用腺病毒基因组特异性引物进行实时定量PCR。在定量曲线的线性范围内,Ct值与已知拷贝数质粒的Ct值的比值即为病毒基因组的初始拷贝数。

 

1. 纯化腺病毒基因组DNA

腺病毒颗粒基因组DNA外面包被有衣壳蛋白,使用蛋白酶K消化酶解病毒衣壳。

组成成分   体积

病毒液 5µl

蛋白酶 K (5µg/µl)      1µl

超纯水               4µl

 

1) 37 ºC 孵育30 min。然后加热 95 ºC 20 min 使酶失活;

2)3000g 离心10 min,取上清冻存。

 

2. QPCR:

1)Vigene使用的病毒标准品的滴度为 3.6X108 VP/ml。梯度稀释标准品至滴度为 3.6×102-3.6×108 ,并将超纯水作为阴性对照;

2)配制PCR反应体系,每个样品20 µl体系;

组成成分            体积

2X SYBRGreen缓冲液 10µl

引物混合物 1µl

超纯水             7µl

病毒样品或标准品                2 µl(相当于加入1μl初始病毒样品)

  

样品应按下表准备:

  

3)进行PCR反应;

4)病毒颗粒数的计算:病毒颗粒数(VP/ml) = 与标准品相对值×1000 。




























        

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