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腺病毒包装流程
发布日期:2017-06-08 浏览次数 :

  1) 293细胞分盘

  转染前一天,将已经长好的细胞以合适的比例传代到6 cm培养皿中,当细胞长到70%~80%时准备转染。

  2) 转染前换液

  转染前1~2 h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基。

  3) 转染

  取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管,转染体系按下表:

腺病毒包装

  混匀后,室温放置15min-20min后,均匀滴加到提前换过液的培养皿中,后置于CO2培养箱中培养。

  4) 加Enhancing buffer

  转染10~12h后,均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染,120μl/皿。

  5) 换液

  转染18~20h后,小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中(注意:此时培养基中已含有少量的病毒,必须经处理后才能丢弃,所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡至少20min后才能丢弃),然后加15ml无血清的DMEM(或加含血清的DMEM,具体的按客户要求)继续培养。

  6) 病毒收集

  病毒收集前要观察病毒空斑是否形成,感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑,一般在10至21天内形成,收集细胞及上清,反复冻融三次收集病毒,以此病毒为P1代病毒。

  7)病毒扩增

  以P1代腺病毒感染293细胞,连续进行三代感染,至P4代进行腺病毒的大量扩增,待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。

  8) 病毒纯化

  病毒纯化采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒,CsCl梯度的制备方法如下:加入2.0ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液,然后缓慢加入3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液,再加入5ml的病毒悬浮,20000rpm,室温离心2小时。

  收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA-Na2煮沸10min)。在透析缓冲液(50g蔗糖,10ml 1M Tris-HCl,PH8.0,2ml 1M MgCl2定容至1L)中,4℃搅拌透析过夜,中间换一次透析液。收集病毒,测定病毒滴度。

  9)病毒重悬和保存

  适量PBS重悬病毒沉淀,一周内使用则置于4度冰箱保存,如需长时间存放需置于-80度甚至液氮保存。

  293细胞的培养

  1)从液氮罐中取出冻存的细胞并迅速放入37℃热水中,轻轻晃动使细胞快速解冻。然后用70%的酒精擦拭细胞冻存管,拿入超净台中操作。以后所有步骤都应注意无菌操作。

  2) 将冻存的细胞转移到15ml离心管中,后加4mL提前预热的培养基并轻轻混匀。1000 rpm离心5min。小心弃掉上清,并用适量培养基重悬细胞。

  3)轻轻将细胞吹打散开,并转移到无菌的细胞培养皿中,置于37℃,CO2培养箱中培养。

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