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维真生物:慢病毒感染过程
发布日期:2016-09-23 浏览次数 :

  慢病毒感染步骤

  包装细胞系:293FT

  生长培养基:DMEM+10%HI FBS+1%P/S+0.5mg/mlG418

  4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐 慢病毒培养基:DMEM+10%HI FBS(无抗生素)

  4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐 目的细胞培养基: DMEM 或者其他培养基+10%FBS,不含抗生素。

  转染过程:

  第一天:准备DNA-lipofectamine 2000复合物

  a.准备一个5ml EP管,各加入1ug pLP 1 , pLP 2,pLP/SVG以及1ug的慢病毒表达质粒,在50ul(250ul)的OPTI-MEM培养基里面。

  b. 准备一个5ml EP管,加入10ul(6ul) lipofectamine 2000,在50ul(250ul) OPTI-MEM培养基里面.(轻轻混匀,室温放置5min) c.将步骤a和步骤b轻轻混匀

  d.室温放置20min,使其充分形成脂质体复合物,可能会出现浑浊,但是不影响转染

  e.在形成脂质体复合物的过程中,消化,计数293FT,将细胞稀释在慢病毒培养基中,调整至1.2x106/ml。

  f.在6孔板中,加入DNA-脂质体复合物100ul(500ul)以及慢病毒培养基0.9ml g.添加0.9ml细胞悬液(大约1x106)至6孔板中。轻轻混匀,37℃培养过夜。

  第二天

  换液,将培养液(含脂质体)换掉,加入慢病毒培养基2ml,培养48h,观察细胞融合状况。 注意:换液动作一定要轻,换液不用PBS洗

  第三天

  将待转染的细胞(BE2-C,SHEP1)用不含抗生素培养基培养,并用合适的浓度,等到第二天大约在30%的密度

  第四天

  a. 收293FT细胞产生的病毒上清液,用0.45um的微孔滤膜过滤,然后再向293FT细胞里

  面加入慢病毒培养基

  b. 感染细胞,加入1ml的慢病毒培养基以及1ml的病毒液,终浓度为4ug/ml polyberne c. 剩下的病毒液用1.5ml的离心管于-80℃保存,可以保存一年,当用的时候需要融化的时

  候,室温溶解比37℃溶解要好。

  第五或者第六天:第二次感染(重复第四天的操作)

  第六或者第七天:将细胞放置于新鲜的目的细胞培养基中培养 第七天或者第八天:药物选择

        

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