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VigenemCherry-GFP-LC3B自噬双标腺相关病毒
发布日期:2017-06-08 浏览次数 :
 

VigenemCherry-GFP-LC3B自噬双标腺相关病毒产品说明

一.关于自噬及LC3

1. 自噬

大自噬(macroautophagy,也就是通常说的自噬(autophagy),是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分(细胞器、蛋白等)被双层膜的囊泡包裹,形成自噬体(autophagosome,进而传递到溶酶体进行降解的过程。详细来说,自噬过程与内涵体途径(endolysosomal pathway)密不可分(见图1。一方面,自噬体能够与晚期内体(late endosome)融合形成中间囊泡(amphisome最终形成自噬溶酶体(autolysosome;另一方面,自噬体能够直接与溶酶体(lysosome)融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径,自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。

细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下,可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响,从而防止某些疾病的发生(如神经退行性疾病和癌症)。饥饿等也可诱导自噬的发生,通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。


1 自噬过程及其与内涵体途径的关系

(Tom Egil Hansen and Terje JohansenBMC Biology2011)


2. LC3

LC3light chain 3简称于MAP1LC3(microtubule-associated proteins light chain 3),是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切,暴露甘氨酸残基,产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中,LC3-I会被包括Atg7Atg3在内的泛素样体系修饰和加工,与磷脂酰乙醇胺(PE)共价结合,形成LC3-II并定位于自噬体膜上(见图2。哺乳动物中的LC3可分为三种 LC3ALC3BLC3C其中,LC3B作为LC3的一种,同样可以用作自噬的分子标志。


2  LC3在自噬体形成中的作用

(Varuna C. Banduseelaet alPhyciological Genomics2012)


二.自噬流检测方法

细胞经自噬诱导或抑制后,需对自噬流的水平进行观察和检测,常用的技术手段见表1


1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总

Mizushima et al, Cell, 2010

其中,电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限;而由于自噬过程发生快速,通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。

想要准确检测自噬流的变化,需要多种技术手段共同使用,才能达到理想的实验效果,产生具有说服性的实验结果。

三.Vigene自噬双标病毒产品

Vigene mCherry-GFP-LC3B腺病毒

VigenemCherry-GFP-LC3B慢病毒

VigenemCherry-GFP-LC3B腺相关病毒

四.Vigene自噬双标系统的工作原理

未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中,由于mCherryGFP共同表达,细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后,酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭,而mCherry不受影响,进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此,红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多,绿色荧光越少,则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之,自噬体和溶酶体融合被抑制,自噬溶酶体进程受阻(见图3

3mCherry-GFP-LC3B双标系统工作原理

(Tom Egil Hansen and Terje JohansenBMC Biology2011)


4Vigene自噬双标病毒载体图谱

五.VigenemCherry-GFP-LC3B自噬双标操作方法

(一)体外实验

2AAV病毒为例,Vigene为您推荐的MOI104-105,是根HEK293细胞得出的数据,不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前,进行预实验摸索最佳MOI值,推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。

1. 为了节省病毒,推荐使用96孔板进行预实验。

2. 将目的细胞接种于96孔板中,细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。

3. 10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释(10-1),以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

4. 取出提前准备好的96孔板,先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

5. 在加入病毒稀释液后,请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适,是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化,即所加病毒对细胞没有毒性,可以继续培养。

6. AAV病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。

另:如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达。

注:由于AAV组织特异性,体外感染细胞的效率比较低,所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验

(二)体内实验

针对小鼠/大鼠来说,研究不同的方向有不同的AAV注射方法,详情可查阅Vigene官网。

六.常见问题解答

1.重组AAV 安全吗?

迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力

2.哪些血清型的 AAV 可供选择?我该选用哪种AAV?

目前为您提供的AAV 血清型为AAV1AAV2AAV5AAV7AAV6AAV8 &  AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。

 



AAV

Serotype

Muscle

Hepatocyte

Pulmonary

Brain

Retinal pigmented epithelium

Pancreas

Kidney

AAV1

X

 

 

neuons and glial cells

X

X

 

AAV2

 

 

 

 

 

 

X

AAV5

 

 

lung alveolar cells

neuons and glial cells

X

 

 

AAV6

X

 

X

 

 

 

 

AAV7

X

 

 

neurons

X

 

 

AAV8

X

X

 

neurons

X

X

 

AAV9

X

X

X

 

X

X

X

请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?

rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。

4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体? 

纯化的AAV载体在4或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80下长期保存。

5.订制AAV服务,客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?

您可以从我们的人源全长cDNA(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNADNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。

附:Vigene自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图

 



























        

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