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VigenemCherry-GFP-LC3B自噬双标慢病毒
发布日期:2017-06-09 浏览次数 :
 

VigenemCherry-GFP-LC3B自噬双标慢病毒产品说明

一.关于自噬及LC3

1. 自噬

大自噬(macroautophagy,也就是通常说的自噬(autophagy),是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分(细胞器、蛋白等)被双层膜的囊泡包裹,形成自噬体(autophagosome,进而传递到溶酶体进行降解的过程。详细来说,自噬过程与内涵体途径(endolysosomal pathway)密不可分(见图1。一方面,自噬体能够与晚期内体(late endosome)融合形成中间囊泡(amphisome最终形成自噬溶酶体(autolysosome;另一方面,自噬体能够直接与溶酶体(lysosome)融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径,自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。

细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下,可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响,从而防止某些疾病的发生(如神经退行性疾病和癌症)。饥饿等也可诱导自噬的发生,通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。


1 自噬过程及其与内涵体途径的关系

(Tom Egil Hansen and Terje JohansenBMC Biology2011)


2. LC3

LC3light chain 3简称于MAP1LC3(microtubule-associated proteins light chain 3),是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切,暴露甘氨酸残基,产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中,LC3-I会被包括Atg7Atg3在内的泛素样体系修饰和加工,与磷脂酰乙醇胺(PE)共价结合,形成LC3-II并定位于自噬体膜上(见图2。哺乳动物中的LC3可分为三种 LC3ALC3BLC3C其中,LC3B作为LC3的一种,同样可以用作自噬的分子标志。


2  LC3在自噬体形成中的作用

(Varuna C. Banduseelaet alPhyciological Genomics2012)


二.自噬流检测方法

细胞经自噬诱导或抑制后,需对自噬流的水平进行观察和检测,常用的技术手段见表1


1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总

Mizushima et al, Cell, 2010

其中,电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限;而由于自噬过程发生快速,通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。

想要准确检测自噬流的变化,需要多种技术手段共同使用,才能达到理想的实验效果,产生具有说服性的实验结果。

三.Vigene自噬双标病毒产品

Vigene mCherry-GFP-LC3B腺病毒

VigenemCherry-GFP-LC3B慢病毒

VigenemCherry-GFP-LC3B腺相关病毒

四.Vigene自噬双标系统的工作原理

未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中,由于mCherryGFP共同表达,细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后,酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭,而mCherry不受影响,进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此,红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多,绿色荧光越少,则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之,自噬体和溶酶体融合被抑制,自噬溶酶体进程受阻(见图3


3mCherry-GFP-LC3B双标系统工作原理

(Tom Egil Hansen and Terje JohansenBMC Biology2011)


4Vigene自噬双标病毒载体图谱

五.Vigene自噬双标慢病毒操作方法

(一)慢病毒安全操作规范

Vigene慢病毒载体是第三代慢病毒载体,其3' LTR的增强子功能发生缺失,形成了自灭活sefl-inactivatingSIN)的3’ LTR, 5’LTR中的U3区替换成CMV是最安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警惕,严格按照以下操作规范进行:

1.使用慢病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。

2.  请在BL2生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。

3.  请务必穿着实验服,佩戴一次性口罩和手套。

4. 小心操作,避免产生气雾、飞溅或洒落。

5.  被病毒污染的超净工作台,请立即用加入1% SDS70%乙醇溶液擦拭干净;请务必将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的10%漂白粉、84消毒液或0.6%次氯酸钠溶液浸泡1小时以上再丢弃。

6.  装盛慢病毒的实验用品需单独放置及培养,并加以标示。

7.  用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用70%乙醇擦拭培养瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。

8.  离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用组织培养室内的离心机。

9.  实验完毕脱掉手套后,请立即用肥皂和水清洗双手。

10. 对共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。

(二)慢病毒感染目的细胞预实验

不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议在正式实验前,在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI值(使用Vigene慢病毒在HepG2A549Hela细胞中进行MOI摸索获得的参考值,详见(附录7)。

为了节省病毒,推荐使用96孔板进行预实验。操作步骤如下:

1. 第一天细胞的准备

将目的细胞接种于96孔板中,细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。

2. 第二天病毒的稀释

10μL慢病毒原液加入90μL培养液中做1:10稀释(10-1),以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

3. 第二天感染目的细胞

取出提前准备好的96孔板,用准备好的病毒稀释液替代旧培养液,注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

4. 第二至十天观察荧光或检测

慢病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后487296120小时分别观察细胞中荧光表达情况(如果您选择的产品不带有荧光标签,请在487296120小时分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达)。

注意事项:由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同,在加入病毒稀释液后,请于12-24小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。

(三)慢病毒滴度测定

Vigene慢病毒单位为TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。如:病毒滴度为>1×108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

慢病毒的病毒滴度(TU/mL)可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定,具体操作步骤如下:

1.       第一天细胞的准备

96孔板中的每个孔中接种1-4×104 HEK293细胞。

2.第二天病毒的稀释和感染。

Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为:每种病毒准备81.5mL Eppendorf管,每管加入297μL完全培养液,向第一个管中加入33µL病毒原液,混匀后,吸取30µL加入第二个管混匀。依此类推,做8个稀释度(10~10-6)。弃去96孔板中原有的培养液每个稀释度重复3个孔,每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。

实验预览如图:

1.       第五天荧光计数和滴度计算

用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内的荧光细胞数,计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数,假设为A(倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数)和B(倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。

慢病毒病毒滴度计算公式:

病毒滴度 (TU/mL) = A+B×10×1000/2/A孔病毒量(μL

(四)慢病毒感染目的细胞

进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液(培养目的细胞用)稀释。培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。

24 孔培养板为例,进行HEK293细胞的感染实验操作步骤如下:

注意事项:实验前请按照不同的MOI 设置不同的感染孔,并根据MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量。

1. 天细胞的准备

24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3-5×104HEK 293细胞,铺板时细胞的融合率为50%左右,每孔培养液体积为300μL,进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右。

2. 天病毒的准备

根据实验的实际情况和MOI 值,用培养液准确稀释慢病毒原液。

注意事项:可使用PBS缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。

3. 天感染目的细胞

在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液,混匀后放于二氧化碳培养箱(37 5% CO2)孵育过夜。

注意事项:

1)感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,请务必保证加入病毒前,细胞处于良好的生长状态。

2)若慢病毒对目的细胞的感染效率较低,可通过提高MOI  值提高病毒的感染效率,也可在培养液中加入助感染试剂ADV-HR(详见附录1、附录4、附录5来提高病毒的感染效率。

4. 天更换培养液

病毒感染细胞24小时后,更换培养液。

注意事项:换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用,影响细胞生长状态,最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液后继续培养。

5. 天感染效率检测

在倒置荧光显微镜观察荧光,计算慢病毒感染目的细胞的效率。如选择的慢病毒载体不带有荧光标记,可以通过Q-PCR(定量PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。

注意事项:

1)慢病毒表达较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染96小时后观察荧光的表达。

2)感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。

3)感染期间,请根据细胞生长的情况及时换液,以保证细胞良好的生长状态。


三、附录

附录1.   常见问题解答

1.    慢病毒感染后,细胞状态很差,甚至出现死亡,为什么?

慢病毒会对细胞造成一定的毒性,不同细胞对毒性的耐受力不同。建议您降低感染时使用的MOI值,即可在细胞准备时增加铺板细胞的融合率(可提高至70%)或/和降低感染时加入的病毒量。此外,还可选择在感染4小时后换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。

2.    怎样提高慢病毒的感染效率?

细胞良好的生长状态和感染时适合的MOI值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的MOI值来提高病毒的感染效率,必要时可在感染时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率。

3.    助感染试剂ADV-HR的使用浓度和使用方法是什么?

助感染试剂ADV-HR能够显著提高慢病毒的感染效率,并呈现剂量和时间依赖效应(详见附录4)。但较高浓度的ADV-HR具有细胞毒性,影响细胞状态和感染效率。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实验。我们在HEK293中的实验表明(详见附录5),当ADV-HR使用浓度小于等于1.0×10-2mg/mL时,细胞状态良好。

此外,对于较难感染的细胞系(如CNE2)建议使用“孵育法”,即将助感染试剂、慢病毒和一定数量的细胞悬液加至1.5mL Eppendorf管中,轻轻混匀,置于37℃培养箱中孵育0.51小时后转至培养皿中培养;对于较易感染的细胞系(如HepG2)建议使用“直接加入法,即在感染时,直接将助感染试剂、慢病毒滴加至培养皿中。建议您针对目的细胞的具体情况,选择合适的感染方法。

4. 慢病毒载体可插入多大的ORF片段?

一般情况下,慢病毒载体可容纳8 kb插入片段。然而,插入的ORF基因大于4 kb时会大大降低病毒的包装效率,进而影响病毒滴度甚至基因表达。


附录2. Vigene慢病毒感染HEK293细胞案例


109TU/mL

MOI≈10

感染后48小时拍照

附录3. Vigene慢病毒滴度测定案例

3.046×109 VP/mL

3.20×108TU/mL

感染后72小时拍照

附录4.  助感染试剂ADV-HRVigene慢病毒感染中的作用

 


慢病毒滴度:109VP/mL   

感染后48110小时拍照

附录5.  摸索助感染试剂ADV-HR的使用极值实验


实验规模:96孔板(定容至100μL)

ADV-HR浓度:1mg/mL

说明:

1. ADV-HR终浓度在01.0×10-2mg/mL之间对细胞状态无影响;

2. ADV-HR终浓度在2.5×10-2mg/mL时细胞生长缓慢;

3. ADV-HR终浓度在5.0×10-21.0×10-1mg/mL时细胞呈现明显破碎, 2.5×10-15.0×10-1mg/mL时细胞皱缩甚至停止生长。

建议:

1.      请在使用ADV-HR前于目的细胞中进行浓度梯度预实验;

2.      建议ADV-HR的使用浓度不超过2.5×10-2mg/mL

附录6. Vigene慢病毒(shRNA)感染构建稳转株成功案例

 

 


shRNA载体:pLenti-U6-GFP

抗性:嘌呤霉素(Puromycin

筛选周期:三周

附录7. Vigene慢病毒在HepG2A549Hela细胞中的MOI参考值

因慢病毒种类、实验条件、细胞状态、实验人员熟练程度等的不同,以下MOI仅供参考。

务必于实验前进行MOI摸索预实验。

 


慢病毒滴度:3.4×106TU/mL   

感染后48120小时拍照

附录8.Vigene自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图

 

 



























        

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