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质粒提取原理、方法选择及常见问题
发布日期:2017-12-20 浏览次数 :
质粒提取目的

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值,要想从细菌中获得质粒DNA,需要通过质粒提取的方法。

质粒提取的几种方法及原理

质粒提取主要有碱裂解法,煮沸裂解法,小量一步提取法等。

1、碱裂解法原理:根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下,细菌的细胞壁和细胞膜被破坏,基因组DNA和质粒DNA被释放出来,线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性,但两条互补链仍会互相盘绕,并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时,共价闭合环状质粒DNA复性快,而线性的染色体DNA复性缓慢,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

    2、煮沸法裂解:将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性。但是,闭环质粒DNA彼此不会分离,这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构,当温度下降后,闭环DNA的碱基又各自就位,形成超螺旋分子,离心除去变性的染色体核蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA。

煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制备),多至250mL(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。

    3、小量一步提取法:由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上,并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性,机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快,仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢,会形成不溶的网状结构,通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

质粒提取方法选择

质粒提取的方法主要根据质粒DNA分子量的大小,所用细菌的种属,细菌裂解释放DNA后的纯化方法和实验要求来选择。

1、质粒DNA的分子大于15kb时,在质粒抽提过程中容易受损,可以采用比较温和的裂解方法,将细菌悬浮于等渗的葡萄糖溶液中,加入溶菌酶和EDTA破坏细胞壁和细胞膜,这样可以缓解高渗透压的细菌在释放质粒DNA时的压力,保护质粒DNA。

2、小分子的质粒DNA可以选用相对剧烈的方法来分离DNA。可以用煮沸法,碱裂解法或者加入溶菌酶,EDTA和去垢剂裂解细菌。这些方法会使DNA变性,但两条互补链仍会互相盘绕,并紧密的结合在一起,在恢复正常条件后,DNA便会复性。

3、对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用煮沸法。而这些碳水化合物在密度梯度中会紧靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的区带,因此很难避免,而这些碳水化合物可抑制多种限制酶的活性。这类菌株制备质粒时,不宜采用煮沸法。

4、菌株含有限制性核酸内切酶A的不宜使用煮沸法。因为煮沸不能使内切酶A完全失活,在后续实验中再用限制性内切酶消化时,质粒DNA会被降解。此时必须用酚:氯仿进行抽提。

煮沸法时间短,(特点) 操作简单,时间短;(缺点)条件过于剧烈,易造成质粒断裂,回收率较低。

碱裂解法操作简单,(特点) 所得质粒量较多且污染少,(缺点)花费的时间较长。

质粒提取试剂盒选择

1、小提质粒:(特点)简单快速,可高通量提取 ;(浓度)100-200ng/ul;(用途)测序,PCR,腺病毒包装、多数细胞转染实验

2、中提质粒:(特点)质粒DNA量较高,(浓度)0.7-1ug/ul;(用途)测序,多数细胞转染实验

3、大提质粒:(特点)质粒DNA量非常高,杂质少,无内毒素(浓度)0.5-2ug/ul (用途)慢病毒、腺相关病毒包装,多数细胞转染或其他需要大量质粒的实验

大多数试剂盒都是在碱裂解法的基础上优化改进的。

常用的质粒提取试剂盒有:OMEGA,BIOMIGA,Sigma,TaKaRa,promega,天根,康为世纪,生工等。

质粒抽提按得到质粒DNA的量可分为小提,中提,大提。

质粒小提用的菌液量很少,一般1-5ml,提出的质粒DNA量较少,其特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,此质粒DNA可直接用于DNA序列分析,各种酶促反应,PCR以及部分细胞系的转染等对质粒浓度要求不高的实验。维真生物采用高通量小提试剂盒,从1ml菌液中提取质粒,用90ul洗脱液洗脱得到的质粒浓度为100-200ng/ul,可以满足大部分实验要求,也可以直接用于一般的腺病毒包装,不过维真生物慢病毒、腺相关病毒(AAV)包装一般使用大提试剂盒进行抽提,以保证高滴度及稳定的质量。

质粒中提得到的质粒DNA的量介于小提跟大提之间,一般用30-50ml菌液提取,提取的质粒可用于包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。从50ml菌液中提取质粒可到到500ul质粒浓度为0.7-1ug/ul的质粒。

质粒大提是质粒大量提取的简称,有些实验室称之为大抽。质粒大提用于大量菌液的提取,100ml-500ml 均可,大规模地从细菌中将扩增的质粒提取出来。一般的大提质粒试剂盒都是使用纯化柱,提取出来的质粒纯度高,杂质少,无内毒素,一般用于细胞的转染等对质粒纯度高的实验。从200ml菌液中提取质粒,1000ul洗脱液洗脱后得到的质粒浓度为0.5-2ug/ul。 维真生物慢病毒、腺相关病毒(AAV)包装一般使用大提试剂盒进行抽提,以保证高滴度及稳定的质量。

注:在一个细菌细胞中只有5个以下的相同质粒时,该质粒是低拷贝质粒;当在一个细菌细胞中可以有几百个相同质粒时则该质粒是高拷贝质粒。低拷贝质粒在等量的菌体中的数量远低于高拷贝质粒,因此用等量菌体提取质粒时,提取的低拷贝质粒的浓度会很低。维真生物的过表达载体是低拷贝质粒,对于此类质粒载体,若需要大量质粒或者小提质粒的实验效果不好时,则需要加大提取的菌体量,可进行质粒中提或者大提,另外,使用去内毒素的试剂盒抽提质粒时,也会降低最终得到质粒的浓度

质粒提取常见问题及解决方案

质粒提取的常见问题

1、菌液较多:可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳,菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解,导致提取量和纯度偏低,菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解,导致导致提取量和纯度偏低。

   质粒提取使用的溶液I主要是悬浮菌体,溶液II裂解菌体,其中的高浓度NaOH破会细菌细胞壁和细胞膜,使菌体中的质粒DNA释放出来,溶液III主要是中和溶液,使溶液恢复中性环境,利于质粒DNA复性,溶液II中SDS的Na+会被K+置换,SDS变为PDS并结合大分子的基因组DNA,蛋白质和细胞碎片形成不溶物,然后通过离心可以得到含有质粒DNA的上清。因此加入溶液II后要温和地混合,不要剧烈震荡,以免使基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮,可能是由于菌体过多,裂解不彻底,若继续进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀,无法通过离心分离得到含有DNA 的上清液,因此在加入溶液Ⅱ后菌液没有变清亮后可以适当按比例加大溶液Ⅱ和后续溶液Ⅲ的用量。

2、菌液培养时间:使用TB培养基培养菌液的时间一般在17小时左右,菌液OD值在2.5-2.6左右为佳,培养时间短会导致菌体生长不充分,培养时间过长菌体会出现死亡,都会影响收集的菌体量,从而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前,可以将保存的菌种先进行活化,然后再接菌,可使过夜培养的菌液生长更充分,在一定范围内菌体量的增加,可以提高所提质粒的浓度。

3、宿主菌株:宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株,HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它们的衍生菌株,通常因为内源核酸酶的存在,或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下,将会显著影响最终收获量,或者纯化到的质粒容易降解,推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中,如Top10, DH5a进行质粒纯化。

4、质粒拷贝数低:由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体,或者加大提取的菌液量,并减小洗脱时的体积。

5、菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况,导致无法提出质粒,若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

6、碱裂解不充分:使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加裂解液的用量。菌体沉淀未能充分悬浮或悬浮后有较多气泡也会导致裂解不充分,要注意让菌体充分悬浮并将较多的气泡用移液器吸出。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用试剂盒溶液,可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

7、溶液使用不当:溶液II在温度较低时可能出现浑浊,可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液,方可使用。

8、吸附柱过载:不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB或2×YT,菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率,则需减少LB培养液体积。

9、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) :洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。

10、乙醇残留:漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,可置于室温静置20-30分钟,或放到超净台上风吹15分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位,可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。

12、洗脱液不合适:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值,最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用,有利于提高洗脱效率。

13、洗脱体积太小:洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

14、 洗脱时间过短:洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时在说明书的建议时间基础上适当延长静置或者洗脱两次可达到较好的效果。

        

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