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细胞培养那点事儿(基础篇)
发布日期:2018-02-01 浏览次数 :

一、细胞培养的概念

细胞培养技术也叫细胞克隆技术,是指将活体组织或细胞从试验动物体内取出,放在模拟体内生存环境的体外环境中(无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件),使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养技术在生物、医学研究等领域都有着广泛的应用。

二、体外培养细胞的分型


 

机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养,一般持续1-4周;原代培养形成的单层细胞汇合以后,需要进行分离培养,此过程称为传代培养

贴附型细胞主要分为以下几个类型:成纤维细胞型;上皮型细胞;游走细胞型;多型细胞型。悬浮型的则见于少数特殊的细胞,如某些类型的癌细胞及白血病细胞等。

三、细胞培养的条件

在细胞培养过程中,应根据离体细胞的特点和培养条件,提供满足其生长和发育的一些基本生理条件:

1、必须保证在无菌条件下进行。细胞感染微生物后,会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞,甚至死亡。

2、需要提供适宜的温度和CO2浓度。一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37℃,鱼类的温度要低一些。温度过高或过低,均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。在细胞培养过程中需要提供一定量的气体(O2CO2)。CO2具有调节pH和缓冲的作用,一般提供5% CO2

3、细胞离体培养技术的关键是细胞培养基。细胞培养基中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质,如提供能量的物质(N源、C源)、代谢调节控制的物质(无机盐、维生素、激素)。理想的细胞培养液可以同时满足细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质等的全部需要。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4,在此范围细胞生长活跃,增殖速度快,如果PH过低或过高,细胞将因为细胞膜受损而死亡。

四、细胞培养的一般过程

1、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,准备工作中某一环节的疏忽均可导致细胞培养的失败。准备工作的内容包括器皿的清洗干燥与消毒培养基与其他试剂的配制分装及灭菌无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试等

2、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器皿中,这一过程称为取材(如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程)。

3、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示,由所养细胞决定具体量)接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后,立即放入恒温培养箱中,正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否正常(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

注意:培养细胞的密度要根据细胞的特性及传代的时间等来定,无论传代与否,培养基最好不要超过2天就要更换一次。

4、冻存及复苏 为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程如下:


复苏一般采用快融方法,即从液氮中

取出冻存管后,立即放入37℃水浴锅中,使之在一分钟内迅速融解,然后将细胞转入培养器皿中进行培养。复苏过程如下:

注:冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

        

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