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cDNA文库的构建
发布日期:2018-03-16 浏览次数 :


实验原理

cDNA文库是指生物某发育时期或不同组织的细胞所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段,将该片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是已Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,扩增出第一条cDNA链,以第一条cDNA为模板,扩增出反义链,然后给所合成的cDNA加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。cDNA文库常用于(1)用于分离全长基因进而开展基因功能研究;(2)筛选目的基因并直接用于表达;(3)提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。

其基本步骤包括:(1)mRNA的获得。(2)cDNA第一条链的合成。(3)cDNA第二条链的合成。(4)双链cDNA的修饰。(5)双链cDNA的分子克隆。

实验材料

mRNA模板,DTT,蒸馏水,dNTP,EDTA,SDS,乙醇,聚合酶,琼脂糖,DNA聚合酶,T4 DNA连接酶等

离心机,PCR仪,电泳仪,制冰机,移液器等

实验过程

一、反转录酶催化cDNA第一链

1、按照下面的表格配制反转录体系

PolyA+RNA(1ug/ul

10ul

Oligo(dT)

1ul

1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

2.5ul

1mol/L KCl

3.5ul

250 mmol/L MgCl2

2ul

dNTP(每种各5mmol/L

10ul

0.1mmol/L DTT

2ul

ddH2O

补至48ul

表格中的各成分须在冰上预冷,并在冰上进行配制

2、反应体系配制成功以后,吸取2.5ul转移到新的EP管中,并加入0.1ul[α-32P]dCTP(400 Ci/mmol, 10mCi/ml)。将配制好的反应体系放入PCR仪中,37℃孵育1h。

3、孵育结束后,立即向小反应管中加入1ul 0.25mmol/L EDTA,然后将反应管转移到冰上,大反应管则70℃孵育10min后转移到冰上

4、测定小反应管中的总活度和可被TCA沉淀的放射性活度。按照下面的公式计算cDNA第一链的合成量。

[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的 cDNA 第一链(μg)

二、cDNA第二链的合成

1、将下表中的成分依次加入步骤一的大规模反应管中

10 mmol/L MgCl2

70ul

2 mol/L Tris-HCl(pH7.4)

5ul

10 mCi/ml[α- 32 P] dCTP400 Ci/mmol

10ul

1 mol/L (NH4)2SO4

1.5ul

RNase H (1000 单位/ml)

1ul

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I (10 000 单位/ml)

4.5ul

轻柔震荡以后,放入PCR仪中,16℃孵育2-4h。

2、孵育结束后,加入下表中的成分,室温孵育15min。

β-NAD (50 mmol/L)

1ul

大肠杆菌 DNA 连接酶(1000~4000 单位/ml)

1ul

3、然后向反应体系中加入1ul dNTP,2ul T4噬菌体DNA聚合酶,混合均匀后室温下孵育15min。

4、取出3ul测定第二链合成产物中可被TCA沉淀的放射性活度,然后计算cDNA第二链的合成量。

[第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA 第二链合成量/μg

5、向上诉反应体系中加入5ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反应,然后用酚氯仿进行抽提,在0.3mol/L(pH5.2)乙酸钠的存在下,用预冷的无水乙醇沉淀DNA,最后用90ulTE溶解。

6、向DNA溶液中加入10ul 10X T4多核苷酸激酶缓冲液和1ul的T4多核苷酸激酶,室温下孵育15min进行磷酸化。

7、用等体积的酚氯仿对磷酸化后的cDNA进行抽提纯化

8、用Sephadex G-50进行柱层析把cDNA和为掺入的dNTP分开

9、加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇,沉淀经柱层析洗脱下来的cDNA,冰上冰浴15-30min后,在冷冻离心机中已最大转速离心15min,沉淀DNA。用预冷的70%乙醇再次洗涤DNA沉淀,室温晾干后加入80ulTE溶解。

三、连接接头

1、cDNA样品在68℃中加热5min,然后将cDNA样品冷却至37℃,加入10ul 5X T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液和5uldNTP溶液,最后加水补至50ul。37℃孵育15min。

2、加入1ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反应。然后用酚氯仿进行抽提。

3、用Sephadex G-50进行柱层析把cDNA和为掺入的dNTP分开

4、加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇,沉淀经柱层析洗脱下来的cDNA,冰上冰浴15-30min后,在冷冻离心机中已最大转速离心15min,沉淀DNA。用预冷的70%乙醇再次洗涤DNA沉淀,室温晾干后加入13μl的10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶解。

5、将下列成分加入到已削成平末端的DNA中

10×T4 噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液

2ul

800~1000ng 的磷酸化接头

2ul

T4 噬菌体DNA连接酶(105 Weiss 单位/ml

1ul

10 mmol/L ATP

2ul

混匀后,16℃孵育12h

5、取反应液中0.5ul放入4℃冰箱中备用,其余反应液于68℃加热15min已终止连接反应。

6、Sepharose CL-4B 凝胶过滤法分离 cDNA

1) 把一层薄棉推进 1ml 灭菌吸管端部,用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花,用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。

2) 将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连,将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl 的TE(pH7.6)溶液中。将聚氯乙烯管不与连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸,直至吸管内充满缓冲液,用止血钳关闭软管。

3) 在吸管宽端接一段乙烯泡沫管,让糊状物静置数分钟,放开止血钳,当缓冲液从吸管滴落时,即形成层析柱。

4) 将3-5倍柱床体积的含 0.1 mol/L 氯化钠的 TE(pH7.6)洗涤柱子。

5) 用巴斯德吸管吸去柱中 Sepharose CL-4B 上层的液体,将 cDNA 加到柱上,放开止血钳,使 cDNA 进入凝胶。然后用 50μl TE(pH7.6)洗涤盛装 cDNA 的EP管,将洗液亦加于柱上。用含 0.1 mol/L NaCl 的 TE(pH7.6)充满泡沫管。

6) 监测 cDNA 流经柱子的进程。放射性 cDNA 流到柱长2/3位置时,开始用EP管收集,每2滴收集一管,直至将所有放射性洗脱出柱为止。

7) 用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。

8) 从每一管中取出一小份,以末端标记的已知大小(0.2kb-5kb)的 DNA 片断作标准参照物,通过 1%琼脂凝胶电泳进行分析,将各管余下部分贮存于-20℃,直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。

9) 电泳后将凝胶移至滤纸上,盖上一张 Saran 包装膜,并在凝胶干燥器上干燥。干燥过程前 20min 至 30min 于 50℃加热,然后停止加热,在真空状态继续干燥1-2h。

10) 置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续 X 射线曝光。

11)在cDNA的收集管中,加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠(pH5.2)和2倍体积预冷的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀,用冷冻离心机于4℃以最大转速离心 15min,以回收沉淀的 cDNA。

12) 将 DNA 溶于总体积为 20μl 的 10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13) 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于连接的 DNA 总量。

[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到第二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNA 第二链合成量=可用于连接的 cDNA

四、连接

根据实验需要将获得的cDNA连接到所需要的载体上,此处对连接过程不再多做描述。



        

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