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维真慢病毒优秀文章分享
发布日期:2019-04-09 浏览次数 :


研究背景

研究表明,雄激素受体AR不仅能在前列腺癌中发挥重要作用,更能促进乳腺癌的发生发展。通过前期研究作者发现,USP14可以通过其去泛素化酶的活性稳定雄激素受体,促进前列腺癌的生长。本篇文章则主要探究去泛素化酶USP14对雄激素受体阳性乳腺癌发生发展的影响。目前该论文已经发表在《Oncogene》上(IF:6.854)。(本篇文章所用慢病毒产品由维真生物提供)



路线设计

研究者通过siRNAshRNA等工具,敲低USP14的表达,然后检测雄激素受体AR的表达,泛素化水平和降解速率,判定USP14是雄激素受体AR的去泛素化酶。稳定AR的水平,并进一步通过AR的补救实验判定USP14敲低或者抑制引起的乳腺癌细胞的生长抑制是依赖于AR的水平。

 


病毒产品及使用




部分结果分享 



图1  USP14干扰慢病毒感染六种乳腺癌细胞

研究者通过USP14干扰慢病毒感染多种乳腺癌细胞(MDA-MB453MDA-MB 231MCF7MDA-MB 468HCC1937T47D),48h后,利用嘌呤霉素进行筛选,构建稳定表达的USP14 shRNA的乳腺癌细胞株。研究者通过检测GFP的表达来检测干扰慢病毒的感染与筛选效率,通过检测USP14的表达,检测病毒的感染效率。结果如图1所示,USP14干扰慢病毒有着极高的感染效率与基因敲除效率。并且,USP14能调控AR的表达,抑制USP14基因的表达后,雄激素受体AR的表达显著降低。


 


图2  co-IP实验验证USP14AR的泛素化酶

为证明USP14AR的泛素化酶,研究者通过利用co-IP的实验技术,检测乳腺癌细胞MDA-MB-453USP14AR及两种泛素酶的表达。结果如图2所示,研究者发现在敲除USP14基因后,AR泛素化酶的水平显著增加,这说明,USP14的确是AR的去泛素化酶,通过去泛素化途径调节细胞内AR的水平;



图3   Western Blot与免疫荧光技术探究USP14AR的调节作用

接着研究者又通过Western Blot与免疫荧光技术,探究USP14对于AR转移的影响。结果如图3所示,在雄激素条件下,与对照组相比,干扰USP14的表达后,核内外的AR表达均下调(橙色为核外,蓝色为核内),这说明,USP14确是调控了AR的表达而非AR的转移。

        

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