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DREADDs技术

 


1. DREADDs技术



 

DREADDs(designer receptors exclusively activated by designer drugs,只由特定药物激活的受体),是一种基于G蛋白偶联受体所改造的化学遗传学平台,通过将不同的G蛋白偶联受体进行改造,让它能传递人工合成的蛋白质,修改后的受体只能由人工合成的特殊化合物来激活或者抑制,并激活相应的GPCR信号通路,从而引发细胞不同的兴奋性变

   

不同DREADDS对应的细胞内信号通路
(https://obsidiantx.com)


其中,由氯氮平N氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)激活的DREADDs,能选择性地作用于不同的GPCR级联反应,包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin,其中Gq-DREADD和Gi-DREADD应用较为广泛。

 

 


 


2. Gq-DREADD和Gi-DREADD


 

在正常生理条件下,人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型M3(hM3)能与内源性神经递质乙酰胆碱(Ach)结合,然后与Gq类的G蛋白偶联受体耦合,参与Gq类信号通路。人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型M4(hM4)与乙酰胆碱(Ach)结合后与Gi类的G蛋白偶联受体耦合发挥作用,参与Gi类信号通路。

   

hM3Dq 和hM4Di 的DREADD结构和G蛋白耦联特性
(Jürgen Wess et al, Trends Pharmacol Sci.2013)


然而,当将hM3与hM4上的两个保守位点A5.46G和Y3.33C突变后(上图中红色叉号表示),两者均不再与乙酰胆碱结合,而是能与外源添加的CNO高效结合。在CNO刺激下,HM3Dq起到激发神经元的作用,hM4Di则导致神经元的抑制。我们把突变之后的受体称之为hM3Dq和hM4Di。

 

 


 


3. DREADDs研究步骤


 

1、选定合适的DREADDs受体;


2、通过转基因动物或病毒载体,将DREADD基因导入动物体内;


3、动物CNO给药(控制时间或剂量);


4、DREADDs受体的有效性的检测和动物表型检测;

   

Jingwei Jiang,et al.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2017

 

 


 


4.DREADDs应用与策略


DREADDs技术为神经科学家提供了强大的新工具,用于绘制大量中枢神经系统(CNS)功能背后的神经元回路,利用DREADDs技术,通过时间和空间控制的方式打开或关闭特定的神经元,例如,记忆形成、食物摄入调节和觉醒等。

 

DREADD基因靶向常见的两种策略为病毒注射和转基因动物模型。目前已开发出携带DREADD转基因的重组AAV载体,通过添加细胞特异性启动子,配合立体定位注射的方法,实现DREADD基因在不同组织细胞内的精准表达,利用CRE、FLP等技术,进一步实现基因的条件可控性表达,如当客户有CRE的转基因动物时,可直接利用携带DREADD转基因的DIO载体。此外,研究者还可利用一些特殊的AAV血清型等,实现病毒的逆向或跨神经突触的感染。

 

根据DREADDs的研究策略,维真开发出多种化学遗传学的载体,满足客户多样化的需求,下面是部分载体列表:

 

化学遗传学载体

hM3Dq hM4Di
pAAV-GFAP-hM3D(Gq)-mcherry pAAV-GFAP-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mcherry pAAV-CaMKIIa-hM4D(Gi)-mCherry
pAAV-hsyn-hM3D(Gq)-mcherry pAAV-hsyn-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mcherry pAAV-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-hsyn-DIO-hM3D(Gq)-mcherry pAAV-hsyn-DIO-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-CaMKIIa-DIO-hM3D(Gq)-mCherry pAAV-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry

pAAV-TRE-hM3D(Gq)-mcherry

......

 

        

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